如何防止聚丙烯酰胺垂直電泳漏膠現(xiàn)象已成為實(shí)驗(yàn)室研究人員比較頭疼的問(wèn)題！

 1. 固定玻璃板時(shí)，先將厚薄玻璃板在桌面對(duì)齊后在垂直面上稍微向厚板傾斜20度，使底面薄板略高于厚板。

 2. 將固定好的玻板固定于放有海綿墊的制膠架上，固定時(shí)用手稍用力往下壓，此時(shí)封閉的灌膠系統(tǒng)準(zhǔn)備完畢。

 3. 除了以上安裝技巧外，由于海綿橡膠墊用久后會(huì)老化或者損壞，從而導(dǎo)致漏膠的現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生，建議用戶(hù)可以購(gòu)買(mǎi)粘性高柔軟性好的橡膠墊。

常見(jiàn)問(wèn)題及分析 

1. 配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？

 在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。

所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。

 2. SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；

 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

 3.“ 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？

主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。

 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

 4. “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？

主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。

 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

 5. 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？

主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的。

 處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。

 6. 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？

 主要是樣品不溶性顆粒引起的。

 處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

7. 什么是“鬼帶”，如何處理？

 “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過(guò)程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的活性，在WB反應(yīng)中可見(jiàn)其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。

 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來(lái)阻止還原劑的氧化。

 8. 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？

 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。

 處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

9. 為什么電泳的條帶很粗？

 電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因。

 處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓；

 10. 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？

 這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒(méi)有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過(guò)少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。

 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 

11. 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎？ 

這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過(guò)猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。

12. 凝膠時(shí)間不對(duì)，或慢或快，怎么回事？

 通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過(guò)多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。 

13. 電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng)？

 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。

 14.分離膠加上后為什么要立即加水？

 加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。

廣東省佛山市南海區(qū)慧星化工有限公司

 聯(lián)系方式:18664218741

 公司傳真:0757-81826805 

公司地址:廣東省佛山市南海區(qū)大瀝鎮(zhèn)博愛(ài)東路高鳴城慧星化工有限公司